Изучали также влияние объема вводимой пробы на хроматографию белков [1324]. С возрастанием вводимой пробы лактальбумина от 4 мкг до 1 мг (колонка С и, подвижная фаза ацетонитрил/вода [10 мМ раствор ТФК] в объемном отношении 30:70) максимум пика смещался в сторону меньших времен удерживания. Интересно отметить, что при введении 4 мкг получили широкий пик, элюи- рующийся при 9 мин. При наложении хроматограмм проб большего объема на хроматограмму 4-мкг проб этот пик образовал размытый задний фронт пика большей пробы. Наиболее вероятно, это происходит потому, что механизмов удерживания несколько. Белок не только распределяется на гидрофобные октаде- цил-привитые группы, но также образует водородные связи с остаточными си- ланольными группами поверхности. Взаимодействия с образованием водородных связей (возможно, кинетически контролируемые) являются очень сильными по сравнению с распределительными взаимодействиями. Однако существует ограниченное число таких участков с сильной адсорбцией. Когда количество молекул введенного растворителя начинает превышать количество сильно адсорбирующих участков, единственно доступным механизмом удерживания становится более слабый распределительный механизм. Следовательно, максимум пика будет смещаться в сторону меньших времен удерживания. Это не означает, что отсутствуют взаимодействия с образованием влдородной связи. Они проявляются в виде размытого заднего фронта пиков белков. В случае достаточно высокого объема пробы этот задний фронт, хотя он и присутствует, становится хроматографически незначимым.
Процесс осложняется еще и тем, что белки концентрируются в начале колонки в слабой подвижной фазе. Если ввели достаточно белка, образуется его многослойная зона. Поскольку нижние слои не могут десорбироваться, пока не де- сорбируются верхние слои, то в результате имеет место размывание заднего фронта пиков. Следовательно, даже при введении проб очень большого объема значительное размывание заднего фронта пиков может сохраняться.
Степень извлечения белков при низком объеме пробы обычно низка [1325, 1326]. Это обусловлено, наиболее вероятно, комбинацией «необратимо» адсорбированных белков, т. е. удерживаемых сильной водородной связью, и потерей площади пика из-за невозможности точно интегрировать пик с сильно размытым задним фронтом. Следует отметить, что необратимая потеря белка может также происходить на металлических участках хроматографической системы. Этот факт привел к введению «биосовместимых» компонентов ВЭЖХ (например, титана, полиэфирэфиркетона).
|
|
|
АКЦИИ, ПРЕДЛОЖЕНИЯ |
|
Доставка бесплатно! |
Компания «Плазма» предлагает всем новым клиентам бесплатную доставку первого заказа! |
|
| |
НОВОСТИ |
|
15-06-09 |
ООО "ПЛАЗМА" рада сообщить, что с 15 июня 2009 года, появляется новый отдел, теперь мы готовы предоставлять промышленных альпинистов, для работ любой сложности (окраска, мойка, ремонт, реставрация). Все альпинисты имеют соответствующие лицензии. Цены дешевле средних. Звоните, будем рады помочь. |
|
01-06-09 |
ООО "ПЛАЗМА" успешно завершила поставку лакокрасочных материалов для ОАО "РЖД".
Ждем подписания следующего контракта. |
архив новостей...
|
|